Eficácia duradoura e eficaz do biopesticida à base de Bacillus thuringiensis contra Chrysodeixis includens na soja

A lagarta-medideira-da-soja, Chrysodeixis includens (Lepidoptera: Noctuidae), é uma das pragas com potencial significativo de causar danos econômicos na cultura da soja (Glycine max L. Merr.), especialmente na América do Sul. Biopesticidas contendo Bacillus thuringiensis (Bt), aqui denominados biopesticidas Bt, são comumente utilizados para controlar essa praga, e a implementação de culturas geneticamente modificadas que expressam proteínas inseticidas Bt tem auxiliado ainda mais seu manejo.

Os biopesticidas Bt são ferramentas indispensáveis ​​para complementar ou substituir pesticidas químicos, devido à sua maior especificidade de alvo e menor pressão de seleção para resistência. É importante ressaltar que o uso de agentes biológicos de controle de pragas é um elemento importante da sustentabilidade agrícola, permitindo que os agricultores cultivem culturas e commodities sem resíduos químicos. Isso não apenas aumenta o valor de mercado de seus produtos, mas também contribui para a proteção ambiental e a preservação dos serviços ecossistêmicos.

Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram-positiva, formadora de esporos e em forma de bastonete, presente em diferentes ecossistemas, incluindo água, solo, insetos, poeira e folhas de árvores. A principal característica do Bacillus thuringiensis é a produção de cristais parasporais com atividades inseticidas contra várias ordens de insetos, ácaros, nematoides e protozoários durante as fases vegetativa e de esporulação. O processo de infecção começa quando um inseto suscetível consome um complexo esporo-cristal. O pH alcalino no intestino médio do inseto solubiliza o complexo cristalino, e as proteases intestinais ativam protoxinas. Essas toxinas ativadas se ligam a receptores específicos no epitélio do intestino médio, formando poros e causando lise celular, eventualmente levando à morte do alvo à medida que os esporos germinam.

No entanto, em condições de campo, os biopesticidas de Bacillus thuringiensis são propensos à degradação. Fatores como temperaturas extremas, exposição prolongada à radiação ultravioleta (UV), precipitação, orvalho e pH do solo podem reduzir a eficácia das proteínas inseticidas, degradando esporos e cristais. A radiação UV gera radicais livres que levam à oxidação de aminoácidos, particularmente histidina e triptofano. Resíduos de triptofano nas proteínas inseticidas Cry são vitais para os efeitos tóxicos do Bt.

A avaliação da persistência em campo de Bacillus thuringiensis é crucial para sua eficácia e uso mais amplo como agente de controle de pragas. A persistência reduzida pode levar a custos de produção mais altos devido à necessidade de reaplicação frequente ou à adoção de estratégias alternativas de controle. Embora várias estratégias tenham sido desenvolvidas para proteger Bacillus thuringiensis das condições ambientais, quantificar sua persistência em campo, especialmente em termos de eficácia ao longo do tempo, é essencial para o desenvolvimento de estratégias para aumentar sua persistência. Vale ressaltar que a maioria dos estudos de persistência de Bacillus thuringiensis foi conduzida no hemisfério norte, onde as condições climáticas diferem significativamente das deste estudo. Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar a eficácia e a persistência de biopesticidas de Bacillus thuringiensis quando aplicados em diferentes épocas em culturas de soja para controlar a lagarta-medideira (Chrysodeixis includens).

Caracterização Experimental

O experimento foi conduzido em uma universidade no Brasil, utilizando a cultivar de soja transgênica resistente ao glifosato NA 5909 RR, sem expressão da proteína Cry. A soja foi cultivada em sistema de plantio direto, com espaçamento entre linhas de 0.50 m e densidade de 300,000 plantas por hectare. Cada tratamento foi aplicado em parcelas de 60 m² ^, das quais foram coletadas as folhas para análise.

O estudo foi repetido três vezes durante as safras de 2020/21, 2021/22 e 2022/23. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em arranjo fatorial, com um tratamento controle adicional. O primeiro fator foi o horário de aplicação (8h, 12h e 18h) e o segundo fator foi o horário de amostragem após a aplicação (0h, 24h, 48h e 72h). Um tratamento adicional (controle) sem aplicação do produto também foi incluído. Os dados do controle foram utilizados para calcular a mortalidade corrigida de Abbott (%).

Aplicação de tratamento

Os tratamentos foram aplicados em 19 de março de 2021, 21 de fevereiro de 2022 e 4 de abril de 2023, quando as plantas de soja estavam no estádio de desenvolvimento R4. As aplicações foram realizadas com um pulverizador costal pressurizado com CO2, equipado com uma barra de 3.0 m contendo seis bicos de cone oco. Os bicos da série Magno MGA 90°01 foram utilizados em 2021 e 2022, enquanto os bicos da série Teejet TXA 80° 01 VK foram utilizados em 2023. Os bicos foram espaçados a 0.5 m, calibrados para fornecer um volume de pulverização de 100 L ha⁻¹ ^{, produzindo} gotas finas a muito finas.

As condições climáticas durante os períodos de aplicação e amostragem (Tabela 1) foram monitoradas por meio de dados da estação meteorológica automática do Instituto Nacional de Meteorologia (INMET), localizada a menos de 1 km do local experimental.

	2021		2022		2023
Tempo de aplicação (h)	Temperatura (° C)	Humidade relativa (%)	Temperatura (° C)	Humidade relativa (%)	Temperatura (° C)	Humidade relativa (%)
08:00 da manhã	18	93	22	82	19	84
12:00	20	93	23	74	26	54
06:00	27	60	32	43	18	96

Criação de insetos e configuração de bioensaios

As lagartas de Chrysodeixis includens foram criadas com dieta artificial até a fase de pupação. As pupas foram colocadas individualmente em copos plásticos invertidos de 25 mL sobre papel de filtro umedecido até a emergência dos adultos. Os adultos foram então transferidos para gaiolas de PVC forradas com papel amarelo para oviposição. Durante a fase adulta, receberam uma solução de mel a 10%, administrada via capilar, em recipientes plásticos dentro das gaiolas. Após a eclosão, as larvas neonatas foram alimentadas com folhas de soja até o início do bioensaio.

O bioensaio de mortalidade foi conduzido alimentando lagartas de C. includens com folhas de soja pulverizadas com o biopesticida Bt de uma empresa química industrial no Brasil de acordo com seus respectivos calendários de aplicação. As folhas pulverizadas do terço superior da planta foram coletadas, colocadas em sacos plásticos e transportadas para o laboratório. No laboratório, as lagartas foram colocadas em uma mistura gelatinosa de 2.5% de carragenina dentro de vasos plásticos de 100 mL desinfetados. Cada vaso foi infestado com duas larvas de segundo ínstar (L2) (5-7 mm de comprimento) e recebeu uma única folha, na qual as larvas permaneceram e se alimentaram até o final das avaliações. Para cada ano (2021, 2022 e 2023) e tratamento, 84 larvas foram usadas em 42 recipientes medindo 6.8 cm de diâmetro superior x × 4.5 cm de diâmetro inferior x 4.1 cm de altura. Assim, cada tratamento apresentou 6 repetições, compostas por 14 larvas.

Os vasos foram selados e mantidos em ambiente controlado a aproximadamente 25 °C e 65% de umidade relativa. A coleta de folhas e a infestação de lagartas foram repetidas 24, 48 e 72 horas após a aplicação para avaliar o efeito residual do produto na mortalidade das lagartas. A mortalidade foi avaliada 5 dias após a infestação, sendo as lagartas consideradas mortas aquelas que não se movimentavam ao toque.

Consistentes

Em todos os três anos do experimento, houve interação significativa entre o horário de aplicação e o intervalo (em horas) entre a aplicação e a coleta de folhas para infestação. Em 2021, observou-se maior número de lagartas mortas quando o Bt foi aplicado às 8h, principalmente quando as folhas foram coletadas logo após a aplicação (0 e 24 h). Nesse horário, o número de lagartas mortas foi significativamente maior em comparação às aplicações às 12h e 18h. O efeito do horário de coleta também foi evidente, pois foi observada uma diminuição progressiva da mortalidade das lagartas com o aumento do intervalo entre a aplicação e a coleta (Tabela 2).

Ano 2021*
	Tempo de aplicação (h)
Tempo de coleta (h)	8 DA MANHÃ	12h00	6h00
0	12.3Aa	11.2Ab	11.0Ab
24	11.8Aa	10.7Ab	7.7 aC
48	4.7 Ba	3.3 aC	4.0 Cb
72	2.3 aprox	2.0 aprox	2.3 dias
CV (%)	4.62

Ano 2022*
	Tempo de aplicação (h)
Tempo de coleta (h)	8 DA MANHÃ	12h00	6h00
0	10.5Ab	8.83Ac	11.8Aa
24	6.7 Ba	6.0 BB	7.3 Ba
48	4.0 Cb	6.0 Ba	6.2 aprox
72	1.8 Db	3.5 aprox	2.0 Db
CV (%)	5.28

Ano 2023**
	Tempo de aplicação (h)
Tempo de coleta (h)	8 DA MANHÃ	12h00	6h00
0	10.0Aa	7.2Ab	5.7Ac
24	9.7Aa	4.3 BB	4.2 BB
48	6.5 Ba	4.0 BB	4.2 BB
72	4.7 aprox	2.5 Cb	2.3 Cb
CV (%)	5.72

Em 2022, uma tendência semelhante foi observada, embora tenha ocorrido uma exceção quando a aplicação às 18h resultou na maior mortalidade no tempo zero, superando até mesmo o tratamento das 8h. No entanto, ao longo do tempo, as taxas de mortalidade diminuíram mais acentuadamente para as aplicações às 12h e 18h, particularmente 72 h após a aplicação. Em 2023, os resultados foram novamente consistentes com a tendência geral de maior eficácia quando o Bt foi aplicado no início da manhã. O número de lagartas mortas diminuiu mais rapidamente quando o inseticida foi aplicado às 12h e 18h, especialmente 72 h após a aplicação.

Ao analisar os três anos em conjunto, um padrão consistente foi evidente: aplicações realizadas às 8h resultaram nas maiores taxas de mortalidade de lagartas, particularmente nos intervalos de coleta mais precoces (0 e 24 h). Em contraste, aplicações realizadas às 12h e 18h foram geralmente menos eficazes, especialmente 48 e 72 h após a aplicação, onde o número de lagartas mortas foi significativamente menor. Isso indica que, independentemente das variações anuais ou ambientais, a aplicação de Bt durante as primeiras horas da manhã leva a maior atividade biológica e persistência prolongada nas superfícies das plantas tratadas.

Considerando que as folhas foram coletadas após a aplicação e transferidas ao laboratório para infestação em condições controladas de temperatura e umidade, os efeitos observados não estão relacionados à ingestão diferencial por lagartas no campo, mas sim à qualidade da deposição de Bt e sua preservação na superfície foliar no momento da aplicação. Nesse contexto, os dados ambientais registrados (Tabela 1) indicam que as aplicações realizadas no início da manhã ocorreram em condições de temperaturas mais amenas e maior umidade relativa do ar, o que tende a reduzir a degradação de Bacillus thuringiensis por fatores abióticos, como calor e radiação, além de favorecer melhor adesão e distribuição do produto na superfície foliar. Por outro lado, as aplicações realizadas ao meio-dia ou no final da tarde foram expostas a temperaturas mais altas e/ou menor umidade, o que pode ter acelerado a degradação de Bacillus thuringiensis ou prejudicado sua fixação na superfície da planta antes da coleta foliar, reduzindo, em última análise, sua eficácia mesmo em condições padronizadas de laboratório.

Ao estimar a mortalidade usando a equação de Abbott, a eficácia do bioinseticida no controle de pragas é confirmada. Para as amostras de folhas coletadas imediatamente após a aplicação, foi alcançada uma eficácia média de mais de 60% em todos os horários de aplicação ao longo dos anos. Notavelmente, a aplicação realizada às 8h demonstrou uma eficiência ligeiramente superior, ressaltando a importância das condições ambientais durante o processo de aplicação.

Para tratamentos onde as folhas foram pulverizadas e imediatamente infestadas com lagartas, taxas de mortalidade mais altas (%) foram observadas em todos os momentos de aplicação. No entanto, a eficácia declinou acentuadamente ao longo do tempo, resultando em uma curva descendente acentuada. Em 2023, a aplicação de 8 h apresentou uma alta porcentagem de lagartas mortas (%) em vários momentos de coleta, provavelmente devido às condições favoráveis ​​de aplicação. Afetado pelo El Niño em 2023, que trouxe tempo excepcionalmente chuvoso ao Rio Grande do Sul, resultando em alta cobertura de nuvens. Esses fatores podem ter contribuído para maiores taxas de mortalidade de pragas até o ponto de coleta de 72 h em comparação com outros anos.

A aplicação às 8h resulta em uma maior taxa de mortalidade nas primeiras 24 horas. Essa maior eficácia é atribuída às condições favoráveis ​​de aplicação, que aumentam a deposição do produto na folha, aumentando potencialmente o número de esporos viáveis ​​e potencializando a eficácia do Bt.

A persistência de Bacillus thuringiensis em condições de campo impacta significativamente o controle de C. includens. A exposição à luz ultravioleta é um fator importante que contribui para a redução do efeito residual de produtos formulados com Bacillus thuringiensis. Além disso, outros fatores abióticos, como precipitação e umidade do ar, também desempenham papéis cruciais na eficácia do bioinseticida.

Discussão

O controle biológico com Bacillus thuringiensis (Bt) representa uma estratégia eficaz em programas de manejo integrado de pragas (MIP) para o controle de diversas espécies de lagartas, incluindo C. includens. Uma compreensão mais aprofundada da dinâmica de persistência de produtos biológicos e dos avanços na tecnologia de aplicação é crucial para aprimorar os esforços de controle de pragas e otimizar o uso de bioinseticidas.

Este estudo indica que os biopesticidas Bt são menos eficazes no manejo de espécies de C. includens, considerando o critério de controle de 80% para a eficácia do pesticida. É importante ressaltar que se espera que os pesticidas biológicos sejam menos eficientes do que os pesticidas químicos devido à sua menor sensibilidade às condições climáticas. Para aumentar a eficácia e a persistência dos biopesticidas em campo, a incorporação da nanotecnologia para o desenvolvimento de nanobiopesticidas poderia melhorar a estabilidade dos ingredientes ativos.

Diversos estudos de laboratório e de campo demonstraram a eficácia da tecnologia Bt no controle de pragas, particularmente na forma de cultivos Bt, onde as condições climáticas têm impacto mínimo. Estudos demonstraram que os biopesticidas Bt desempenharam um papel essencial no controle de surtos de C. includens e H. armigera em lavouras brasileiras durante a safra 2013/2014, quando as lavouras de soja Bt ainda não estavam acessíveis aos agricultores. Observou-se uma crescente adoção de biopesticidas para o controle de pragas no Brasil em resposta a surtos de pragas, o que é atribuído à sua alta eficácia e ao reduzido impacto ambiental.

Previa-se maior eficácia do produto para aplicações às 06h, devido às condições climáticas mais favoráveis ​​durante um período mais longo. Isso inclui menor incidência de raios UV logo após a aplicação, com continuidade durante a noite sem radiação solar e potencial aumento da eficiência no controle de pragas. Um estudo recente destacou que a suscetibilidade à radiação UV (290-400 nm) limita a persistência e a eficácia dos biopesticidas.

Aplicações conduzidas às 8h também podem ser significativas, pois historicamente, esse horário oferece condições de aplicação mais próximas dos parâmetros recomendados, com maior umidade relativa e menor temperatura em comparação ao horário da tarde. Neste estudo, as diferentes temperaturas não apresentaram um padrão de comportamento no controle de lagartas. Em 2021, a maior temperatura (27 ℃) no momento da aplicação ocorreu às 18h, o que resultou em menor controle quando comparado à aplicação realizada às 8h com temperatura de 6 ℃, nas primeiras horas de coleta foliar (0-24 h). Isso foi diferente do que ocorreu em 2022, onde a aplicação às 6h com temperatura de 32 ℃ apresentou maior controle em comparação à aplicação às 12h, que tinha 23 ℃ no momento da aplicação. estudaram a influência das flutuações diárias de temperatura na eficácia de diferentes bioinseticidas e observaram que o bioinseticida à base de B. thuringiensis var. Kurstaki não foi afetado por flutuações de temperatura nas faixas máxima (17-33 ℃) e mínima (11-22 ℃). Isso pode indicar que outras condições ambientais podem ter influenciado a resposta ao controle, como a precipitação registrada nas primeiras 24 horas após a aplicação em 2022, que levou a uma queda mais acentuada na mortalidade entre os horários de coleta de folhas 0 e 24 horas.

Apesar dos resultados deste estudo, a literatura destaca que o tempo deve ser considerado um fator crucial na aplicação de produtos biológicos. Aplicações durante os horários mais quentes do dia devem ser evitadas devido ao potencial "efeito lupa", em que a luz solar se concentra nas gotas pulverizadas, reduzindo potencialmente a persistência do Bt.

Ao examinar a atividade residual do bioinseticida, testada com diferentes volumes de pulverização, foi relatada uma diminuição na mortalidade ao longo do tempo (1 a 7 dias) após a aplicação. Não foi registrada mortalidade larval de Agoma trimenii (Lepidoptera: Agaristidae) após o sexto dia. Os efeitos residuais desses produtos são caracterizados por uma rápida redução de esporos em condições de campo, com até 95% a 99% dos esporos iniciais sendo eliminados em até 3 dias após a aplicação.

Esses resultados estão alinhados com os relatados em outros estudos, que relataram que a perda de ingredientes ativos aumentou proporcionalmente com a exposição direta à luz solar, e a atividade das formulações de Bacillus thuringiensis diminuiu em poucos dias após a aplicação, com taxas de mortalidade caindo para menos de 40% após 3 dias de exposição solar e atingindo inatividade completa após 10 dias. A avaliação da sensibilidade da Bt kurstaki à radiação UV-B revelou que essa variedade possui um revestimento substancial de proteínas inseticidas Cry em comparação com a Bt israelensis. No entanto, esse excesso de revestimento aumenta paradoxalmente a sensibilidade aos raios ultravioleta devido à deficiência de polipeptídeos protetores.

Neste estudo, a persistência foi analisada sobre a mortalidade de C. includens ao longo do tempo. Amostras de folhas foram coletadas por até 72 h após a pulverização e a infestação. As eficiências de controle em 0 h foram de 76%, 61% e 64% às 08:00, 12:00 e 06:00, respectivamente. Essa eficiência diminuiu para 12%, 10% e 7% em 72 h para os mesmos horários de aplicação. O controle mais efetivo foi observado dentro de 24 h da aplicação, com um declínio significativo na mortalidade em 48 e 72 h. As condições mais quentes típicas de climas tropicais, como as do Brasil, aceleram a perda de esporos e reduzem a persistência do produto.

Estudos recentes na área de tecnologia de aplicação têm se concentrado no encapsulamento de biopesticidas. Essa estratégia envolve o revestimento do produto para aumentar sua persistência em campo, permitindo que ele resista melhor a estresses bióticos e abióticos. Um dos principais objetivos dessas formulações é a vida útil do produto, tanto em campo quanto durante o armazenamento. Uma abordagem alternativa envolve a manipulação de genes cry, aproveitando as diversas proteínas produzidas por bactérias e seus diversos modos de ação. Técnicas de engenharia genética podem ser empregadas para melhorar a eficácia das proteínas e a persistência ambiental, eliminando, ao mesmo tempo, características indesejadas.

Nossos dados sugerem fortemente a necessidade de adotar estratégias para aumentar a persistência de biopesticidas de Bacillus thuringiensis. As aplicações neste estudo utilizaram apenas produtos comerciais sem adjuvantes, o que poderia ter melhorado a tecnologia de aplicação em termos de dispersão e persistência. No entanto, nem todos os adjuvantes são compatíveis com as formulações de Bacillus thuringiensis.

A Dora Agri é a principal fornecedora de Bacillus thuringiensis aizawai e outros produtos bioinseticidas. Nossa missão é ajudar os produtores a reduzir o uso de pesticidas químicos, cultivar safras mais saudáveis ​​e obter maiores lucros.